Aun cuando se sabe que las propiedades de las enzimas “in situ” pueden ser muy diferentes a las de las enzimas puras estudiadas en el laboratorio, está plenamente justificada la necesidad de tener preparaciones puras para hacer el estudio químico completo de su actividad. En la actualidad se han cristalizado o purificado de manera adecuada cerca de unas 200 enzimas (del posible total de unas 5000).
Para extraer las enzimas de las células que las contienen, a menudo es necesario dividir finamente el tejido, por medio de un homogeneizador o una licuadora; los tratamientos más enérgicos comprenden la molienda del tejido con arena el empleo de vibraciones ultrasónicas, los procesos alternados de congelamiento y descongelamiento, la autolísis , el desecado con calor o el empleo de solventes como la cetona, el éter y el tolueno. El desecado con acetona y la producción de los llamados polvos acetónicos constituyen un excelente ejemplo de rotura de la membrana celular y la obtención de un material rico en enzimas y de fácil conservación. Cuando las enzimas están asociadas a lípidos, como sucede con las enzimas mitocondriales, es ventajoso el tratamiento con sustancias de tipo detergente o con butanol que disgregan la estructura lipoprotéica y permiten la salida de las enzimas.
La purificación de las enzimas con método de precipitación fraccionada recurre a diversos procedimientos, el cambio de pH quita las nucleoproteínas y el material grueso, con lo que se facilitan los pasos siguientes.
Con el empleo del calor a veces se logra la desnaturalización de material protéico inactivo; por ejemplo, en la purificación de la transaminasa se añade el sustrato de la enzima – ácido a - cetoglutárico – al homogenado y se calienta hasta 65° C, con lo que muchas enzimas se desnaturalizan y precipitan, lo que no sucede con la transaminasa así protegida.
En otros casos se emplean solventes orgánicos como el etanol, muy utilizado para separar diversas proteínas del suelo sanguíneo y la caetona; o las sales, como el sulfato de amonio, que es muy soluble en agua, por lo que se puede manejar a elevadas concentraciones, y en general no ataca la estructura de las enzimas. La absorción fraccional tiene gran utilidad para absorber gran material indeseable o para absorber la enzima y luego desprenderla del material absorbente en una forma más pura; muy usado con este fin en el gel de aluminio C.
El paso final de la purificación es el de la cristalización de la enzima que debe repetirse varias veces pues los primeros cristales suelen estar contaminados con otras enzimas. A pesar de esto, la obtención de cristales no demuestra que la enzima esté 100% pura, es solo obtención de una actividad específica de un valor constante ante las recristalizaciones repetidas la que ofrece la seguridad de su pureza.
El estudio de la pureza de una enzima comprende la aplicación de las técnicas empleadas para el estudio de la pureza de las proteínas, el análisis por ultracentrífuga, el análisis el electroforético, etc. Sin embargo, aún es posible, si se somete la enzima a fraccionamientos más sensitivos, como los de la electroforesis en gel de agar, de almidón, o de acrilamida demostrar que la enzima en cuestión puede estar formada por varias proteínas, algunas de las cuales tienen la misma actividad enzimática, pero que por tener propiedades físicas o estructurales diferentes se deben considerar como isoenzimas, y otras que son proteínas que se han procesado a lo largo de todas las etapas de purificación.
En general las enzimas se consideran especies químicas homogéneas y puras cuando llenan requisitos como los siguientes: su actividad no debe aumentar después de que se la recristaliza repetidas veces; su solubilidad no aumenta al elevar la cantidad de cristales de la proteína problema que se pone en solución; tanto en el análisis realizado con la ultracentrífuga como en los diversos métodos electroforéticos se encuentra un patrón de movilidad único y persistente.
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