Etapas en la preparación de

I: Preservación del inóculo

La preservación de las cepas de producción a lo largo de un período de tiempo largo es un requisito básico para una fermentación práctica. El objetivo no es la mera supervivencia de las cepas. Los microorganismos pueden ser mantenidos viables fácilmente a través de un período de transferencia, pero lo que debe ser preservado es su capacidad de formar el producto de interés. Las cepas superproductoras están frecuentemente dañadas en su metabolismo primario durante el proceso de selección de cepas y tales cepas frecuentemente degeneran durante las sucesivas transferencias, probablemente como resultado de mutaciones espontáneas (revertientes).

El objetivo de la preservación es, por consiguiente, mantener las cepas durante tanto tiempo como sea posible sin división celular. Las cepas maestras no deberían ser cultivadas más que una vez cada dos años controlando los niveles de actividad con cada uso. Dependiendo de la cepa, deben ser llevados a cabo periódicamente programas de selección. Las cepas de trabajo derivan de las cepas maestras. Las cepas de trabajo deben ser inspeccionadas en relación a su pureza y su capacidad de formar producto para posteriormente ser almacenadas hasta su uso.

Etapa II: Crecimiento del inóculo

El cultivo preservado se reaviva inicialmente mediante crecimiento en un cultivo líquido en agitación o en medio sólido si se requiere la formación de esporas. Las condiciones utilizadas en el cultivo inicial (composición del medio, temperatura de incubación, etc.) dependerán del proceso específico. Los tiempos normales de incubación serán, tentativamente, los que aparecen en la tabla de la transparencia.


Etapa IV: Fermentación de producción

Dependiendo de la fermentación se utilizan biorreactores de distinto tamaño y no puede darse un esquema general para la inoculación de un fermentador de producción.

Etapa III: Precultivo en fermentador

A fin de obtener suficiente inóculo para el fermentador de producción, deben realizarse precultivos en fermentadores más pequeños. Si un fermentador de producción se inicia con demasiado poco inóculo, el crecimiento se retrasa y la velocidad de formación del producto puede ser insatisfactoria. La concentración óptima del inóculo para el fermentador de producción determina el número de etapas del precultivo de fermentación que son necesarias. En general se requieren las siguientes concentraciones de inóculo:

Actinomicetos...........5 - 10 %
Otras Bacterias..........0,1 - 3,0 %
Hongos..................5 - 10 %

A veces el medio de cultivo de producción se utiliza en la última etapa de formación del inóculo a fin de inducir la formación del producto.

Etapas de producción en antibióticos

Los antibióticos son producidos a escala industrial en un proceso de la fermentación, donde el microorganismo productor se crece en envases grandes (100.000-150.000 litros o más) que contienen un medio de cultivo líquido. La concentración de oxígeno, la temperatura, el pH y los niveles nutrientes deben ser óptimos dependiendo del microorganismo productor. Pues los antibióticos son metabolites secundarios (producidos en la idiofase) y el tamaño de la población se debe controlar muy cuidadosamente para asegurarse de que la producción máxima está obtenida antes de que las células mueran (quimiostato). Una vez que el proceso finalice, el antibiótico se debe extraer y purificar. Lo que sería simple de alcanzar, si el antibiótico es soluble en solvente orgánico. Si no, debe ser eliminado en un intercambiador iónico, por adsorción o por productos químicos

Preparacion de antibioticos.

El proceso de elaboración de un nuevo antibiótico es largo y costoso. Primero debe identificarse el organismo productor del antibiótico, y el antibiótico debe probarse frente a una amplia variedad de especies bacterianas. A continuación el microorganismo debe cultivarse a gran escala para permitir la purificación y el análisis químico del antibiótico y para diferenciarlo de otros antibióticos. Esto es un proceso complejo debido a que existen miles de compuestos con actividad antibiótica y tales compuestos son redescubiertos de manera cíclica. Cuando el antibiótico ha demostrado su eficacia en el tratamiento de infecciones en animales, se puede iniciar su preparación a gran escala.

En el proceso de comercialización se requiere un método de purificación económico y productivo. Se realiza una intensa labor investigadora para aumentar la productividad seleccionando cepas mejoradas del microorganismo o cambiando el medio de cultivo. Se cultiva entonces el microorganismo en grandes tinajas de acero con sistemas de ventilación forzada. El producto fermentado de forma natural puede ser modificado químicamente para producir antibióticos semisintéticos. Tras el proceso de purificación, los efectos del antibiótico en los órganos y tejidos del huésped (su farmacología), así como los posibles efectos tóxicos (toxicología), deben ser analizados en gran número de animales de diferentes especies. Además se deben determinar las formas de administración más efectivas. Los antibióticos pueden ser tópicos (aplicados en la superficie de la piel, ojo, u oído en forma de cremas o pomadas). Pueden ser orales (se administran por la boca y se disuelven en la boca o se ingieren, para su absorción posterior en el intestino y su paso a la corriente sanguínea). Los antibióticos también pueden administrarse de forma parenteral: por inyección intramuscular, intravenosa o subcutánea; se utiliza esta vía de administración cuando se requiere una absorción rápida.

En distintos países, una vez completados estos pasos previos, el productor solicita un ensayo clínico a la agencia de control de medicamentos. Si se aprueba la solicitud, el antibiótico se prueba en voluntarios para determinar la toxicidad, tolerancia, absorción y excreción (fase 1). Si las pruebas sucesivas en un pequeño número de pacientes se realizan con éxito (fase 2), el fármaco puede emplearse en un grupo más amplio de varios cientos de personas (fase 3). Más tarde, se solicita a la agencia de control de medicamentos la inclusión como fármaco nuevo; debe obtenerse una autorización comercial para la utilización generalizada del medicamento en la práctica médica. El proceso que va desde el descubrimiento del antibiótico en el laboratorio hasta su ensayo clínico se suele prolongar a lo largo de varios años

Metodos de produccion de antibioticos.

La penicilina G y la penicilina V son producidas utilizando procesos sumergidos en fermentadores de 40.000-200.000 litros. Debido a las dificultades en el suministro de oxígeno no pueden ser empleados tanques mayores. La fermentación de penicilina es un proceso aeróbico con una velocidad de absorción volumétrica de oxígeno de 0,4-0,8 mM/l min. La velocidad de aireación requerida está entre 0,5-1,0 vvm dependiendo de la cepa, del biorreactor y del tipo de impulsor. Para el mezclado se suelen utilizar varios impulsores de tipo turbina (120-150 rpm). El rango de temperatura óptima es de 25-27°C.

Un esquema típico de producción de penicilina se muestra en la figura. El inóculo se inicia utilizando esporas liofilizadas. Debido a la gran variabilidad de las cepas de alta producción, es necesario el mantenimiento cuidadoso de las cepas. La concentración de esporas (óptima 5x103/ ml) y la formación de agregados son cruciales para el rendimiento subsecuente. Si se quiere conseguir una velocidad óptima de formación de penicilina, los agregados (pellets) no deben crecer como bolas compactas sino de una forma suelta.

Después de varias etapas de crecimiento está preparado el cultivo de producción. En la fermentación típica de penicilina existe una fase de crecimiento de c.a. 40h con un tiempo de duplicación de 6h, durante la cual se forma la mayor parte de la masa celular. El suministro de oxígeno es crítico en el cultivo en crecimiento ya que el aumento de la viscosidad dificulta la transferencia de oxígeno. Después de la fase de crecimiento, el cultivo llega a la fase real de producción de penicilina. Debido al aporte de distintos componentes al medio, la fase de producción puede extenderse hasta 120-160h.

El medio de un cultivo típico alimentado puede variar dependiendo de la cepa, y generalmente consiste en:

• Líquido de maceración de maiz (4-5% peso seco).

• Una fuente de Nitrógeno adicional, harina de soja, extracto de levadura o suero.

• Una fuente de carbono, lactosa.

• Varios tampones

• El pH se mantiene constante a 6,5.

• El ácido fenilacético o el fenoxiacético se alimentan continuamente como precursores (0,5-0,8% del total).

Los procesos con alimentación de glucosa o melazas también tienen éxito. En estos casos las velocidades de alimentación son de 1.0-2.5 kg*m-3*h-1, con una concentración de glucosa de 500 kg*m-3.

Aproximadamente el 65% de la fuente de carbono metabolizada se utiliza para el mantenimiento energético, el 25% para el crecimiento y sólo el 10% para la producción de penicilina.

Se ha intentado la producción de penicilina por fermentación continua, pero ha sido difícil debido a la inestabilidad de las cepas de producción. Como alternativa se ha sugerido un sistema de "tanque de llenar y sacar". En este procedimiento el 20-40% del contenido de la fermentación se saca y se reemplaza con solución fresca de nutrientes; este proceso puede ser repetido hasta diez veces sin reducción del rendimiento.

Se está llevando a cabo una intensa investigación para producir penicilina con células inmovilizadas. En un estudio a escala de laboratorio se demostró la ventaja de este enfoque sobre el uso de sistemas discontinuos alimentados, pero esta técnica no ha sido introducida todavía a nivel comercial.

La penicilina es excretada al medio y menos del 1% permanece unida al micelio. Después de la separación del micelio, la recuperación del producto se lleva a cabo por medio de dos etapas de extracción continua en contracorriente del caldo de fermentación con acetato de amilo o de butilo a 0-3°C y pH: 2,5-3,0. El rendimiento es de alrededor del 90%.

Introducciòn de Antibiòticos

               

             Microorganismos y vacunas      

   

Las vacunas pueden estar compuestas de bacterias o virus, ya sean vivos o debilitados, que han sido criados con tal fin. Las vacunas también pueden contener organismos inactivos o productos purificados provenientes de aquellos primeros. Hay cuatro tipos tradicionales de vacunas:

• Inactivadas: microorganismos dañinos que han sido tratados con productos químicos o calor y han perdido su peligro. Ejemplos de este tipo son: la gripe, cólera, peste bubónica y la hepatitis A. La mayoría de estas vacunas suelen ser incompletas o de duración limitada, por lo que es necesario más de una toma.

• Vivas atenuadas: microorganismos que han sido cultivados expresamente bajo condiciones en las cuales pierden sus propiedades nocivas. Suelen provocar una respuesta inmunológica más duradera, y son las más usuales en los adultos. Esto se debe a que el microorganismo no se encuentra inactivado y conserva su estructura. Por eso, en muchas ocasiones puede provocar la enfermedad en personas inmunodeprimidas. Por ejemplo: la fiebre amarilla, sarampión o rubéola (también llamada sarampión alemán) y paperas.

• Toxoides: son componentes tóxicos inactivados procedentes de microorganismos, en casos donde esos componentes son los que de verdad provocan la enfermedad, en lugar del propio microorganismo. Estos componentes se podrían inactivar con formaldehido, por ejemplo. En este grupo se pueden encontrar el tétanos y la difteria.

• Subunitarias: introduce un microorganismo atenuado o inactivo, dentro del sistema inmunitario, para crear una respuesta inmunitaria. Un ejemplo característico es la vacuna subunitaria contra la hepatitis B, que está compuesta solamente por la superficie del virus (superficie formada por proteínas).

La vacuna contra la tuberculosis por ejemplo, es la llamada vacuna BCG (Bacilo de Calmette y Guerin, que debe su nombre a sus descubridores) se fabrica con bacilos vivos atenuados y por tanto no es contagiosa de esta enfermedad.

Hoy día se están desarrollando y probando nuevos tipos de vacunas:

• Conjugadas: ciertas bacterias tienen capas externas de polisacáridos que son mínimamente inmunitarios. Poniendo en contacto estas capas externas con proteínas, el sistema inmunitario puede ser capaz de reconocer el polisacárido como si fuera un antígeno (un antígeno puede ser una proteína o un polisacárido). De esa manera generamos anticuerpos contra la bacteria y contra el polisacárido (exopolisacárido, en este caso). Este proceso es usado en la vacuna Haemophilusinfluenzae del tipo B (también conocido como bacilo de Pfeiffer).

• Vector recombinante: combinando la fisiología (cuerpo) de un microorganismo dado y el ADN (contenido) de otro distinto, la inmunidad puede ser creada contra enfermedades que tengan complicados procesos de infección. Los esfuerzos para crear vacunas contra las enfermedades infecciosas, así como inmunoterapias para el cáncer, enfermedades autoinmunes y alergias han utilizado una variedad de sistemas de expresión heteróloga, incluyendo vectores virales y bacterianos, así como construcciones recombinantes de ADN y ARN ^[4] .

• Vacuna de ADN: vacuna de desarrollo reciente, es creada a partir del ADN de un agente infeccioso. Funciona al insertar ADN de bacterias o virus dentro de células humanas o animales. Algunas células del sistema inmunitario reconocen la proteína surgida del ADN extraño y atacan tanto a la propia proteína como a las células afectadas. Dado que estas células viven largo tiempo, si el agente patógeno (el que crea la infección) que normalmente produce esas proteínas es encontrado tras un periodo largo, serán atacadas instantáneamente por el sistema inmunitario. Una ventaja de las vacunas ADN es que son muy fáciles de producir y almacenar. Aunque en 2006 este tipo de vacuna era aún experimental, presenta resultados esperanzadores. Sin embargo no se sabe con seguridad si ese ADN puede integrarse en algún cromosoma de las células y producir mutaciones.

Es importante aclarar que, mientras la mayoría de las vacunas son creadas usando componentes inactivados o atenuados de microorganismos, las vacunas sintéticas están compuestas en parte o completamente de péptidos, carbohidratos o antígenos. Estas sintéticas suelen ser consideradas más seguras que las primeras.

Proceso de Elaboración de Vacunas.

Mencionamos en seguida el proceso de elaboración de vacunas según el capítulo 35 de la primera edición del libro del profesor Salleras que tiene un apartado específico que habla de las etapas en el desarrollo y la evaluación de una vacuna.

En él, citando a Bach, divide de forma esquemática el proceso de desarrollo y evaluación de una vacuna en las siguientes etapas:

A) Fase de ciencia básica
B) Fase de ciencia postbásica                                                
C) Fase de ensayos preclínicos en modelos animales
D) Fase de ensayos clínicos: fase I, II, III y IV

De la primera fase, de ciencia básica, decir que se hacen las investigaciones preliminares sobre la vacuna en el laboratorio, se evalúa la necesidad de la vacunación para la prevención de la enfermedad y se establece la factibilidad de su aplicación a la población en riesgo.

Mediante estas investigaciones se identifican los antígenos inmunizantes protectores potencialmente utilizables, se caracterizan y purifican y se llevan a cabo pruebas preliminares de protección en animales de experimentación.

En la ciencia postbásica en el laboratorio, en primer lugar, se investigan en modelos animales las características fisicoquímicas, funcionales e inmunológicas del antígeno inmunizante.

En segundo lugar se desarrollan las especificaciones descriptivas y normativas del producto.

En tercer lugar se decide su formulación, vehículo, proteínas transportadoras en su caso, adyuvantes, conservantes y otros excipientes, considerándose asimismo la posibilidad de su combinación con otros antígenos vacunales. Y, finalmente, se desarrollan los procedimientos de fabricación, así como los métodos analíticos para el control de calidad de las vacunas.

En la fase de ensayos preclínicos el objetivo es establecer que ni el antígeno ni la vacuna son perjudiciales para los animales de experimentación y que inducen una reacción inmunológica de tipo humoral y/o celular protectora aceptable.

Finalmente, se procede a las fases de experimentación en humanos que finalizan con los ensayos en fase IV también denominación de postcomercialización.